扫描电镜(SEM)下微生物样品制备的完整指南27

扫描电子显微镜（SEM）以其强大的成像能力，能够提供微生物样品高分辨率的三维图像，在微生物学研究中发挥着至关重要的作用。然而，要获得高质量的SEM图像，关键在于样品的前处理步骤。微生物样品本身极其细小且脆弱，直接进行SEM观察往往无法获得理想的结果，因此需要进行一系列的预处理，才能将样品以最佳状态呈现于显微镜下。本文将详细介绍微生物SEM前处理的各个步骤，并讨论不同方法的选择和注意事项。

一、样品采集与固定

样品采集是整个实验过程的第一步，也是至关重要的一步。采集方法的选择取决于研究目标和微生物的类型。对于液体样品，可以采用离心或过滤的方法富集微生物；对于固体样品，则需要用无菌的工具小心刮取或切取样品。采集到的样品应立即进行固定，以防止微生物的形态发生变化或降解。常用的固定剂包括戊二醛、多聚甲醛以及两者混合使用。固定时间需要根据微生物种类和样品大小进行调整，一般在几小时到几天不等。固定后，需要用缓冲液冲洗干净，以去除残留的固定剂。

二、脱水

SEM成像需要样品处于干燥状态。微生物样品中的水分会影响成像质量，甚至导致样品结构破坏。因此，脱水步骤是必不可少的。常用的脱水方法包括梯度乙醇脱水法和临界点干燥法。梯度乙醇脱水法是将样品逐步浸泡在不同浓度的乙醇溶液中，逐步去除样品中的水分。这种方法操作简单，但容易导致样品表面张力收缩，造成样品变形。临界点干燥法则是在临界点条件下，将样品中的水分以气态形式排出，避免了表面张力对样品的破坏，能够得到更好的样品形态。但临界点干燥仪器价格昂贵，操作也比较复杂。

三、喷金或喷镀

微生物样品通常是非导电的，直接进行SEM观察会产生充电效应，导致图像模糊不清，甚至损坏样品。为了解决这个问题，需要对样品进行喷金或喷镀处理，在样品表面镀上一层导电薄膜。常用的镀膜材料包括金、铂、铬等。喷镀的厚度需要根据样品大小和SEM的工作电压进行调整。喷镀厚度过薄，导电性不足，仍会产生充电效应；喷镀厚度过厚，则会掩盖样品表面的细节。

四、不同微生物样品前处理的特殊考虑

不同类型的微生物具有不同的特性，需要根据其特性选择合适的前处理方法。例如，对于一些比较脆弱的微生物，例如某些细菌和真菌，需要特别小心地进行处理，避免破坏其结构。对于一些具有特殊表面结构的微生物，例如具有鞭毛的细菌，需要选择能够保留其结构的方法。对于生物膜样品，则需要考虑如何将其完整地固定和脱水，并尽可能减少对生物膜结构的破坏。

五、其他预处理方法

除了上述常用的方法外，还有一些其他的预处理方法，例如，对于一些需要观察内部结构的微生物，可以采用超薄切片技术；对于一些需要进行免疫标记的微生物，可以采用免疫金标记技术。这些技术能够提供更丰富的样品信息。

六、结果分析与图像处理

获得SEM图像后，需要进行图像分析和处理，以获取有用的信息。图像分析软件可以帮助我们测量微生物的尺寸、形状以及其他特征参数。图像处理软件可以帮助我们去除图像噪声，增强图像对比度，以及进行三维重建等。

七、总结

微生物SEM前处理是一个复杂的过程，需要根据样品类型和研究目的选择合适的方法。掌握正确的样品制备技术对于获得高质量的SEM图像至关重要。熟练掌握各个步骤，并根据实际情况进行调整，才能获得最佳的实验效果，为后续的研究提供可靠的数据基础。 此外，良好的实验记录和规范的操作流程也是保证实验结果可靠性的关键。

2025-04-11

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