细菌扫描电镜制样及样品置换技术详解176

扫描电子显微镜 (SEM) 作为一种强大的成像技术，被广泛应用于微生物学研究，特别是细菌形态结构的观察。然而，细菌样品的制备对于获得高质量的SEM图像至关重要。由于细菌体积微小且易受电子束损伤，其样品制备过程比其他样品更为复杂，其中样品置换技术扮演着关键角色。本文将详细探讨细菌SEM制样过程中的样品置换技术，并分析不同方法的优缺点。

传统的细菌SEM制样流程通常包括固定、脱水、干燥和镀膜等步骤。其中，干燥步骤是影响图像质量的关键环节，不当的干燥方法可能导致细菌细胞结构收缩、变形甚至崩解，从而无法真实反映细菌的形态特征。而样品置换技术正是为了克服传统干燥方法的不足而发展起来的。它通过使用一种与水相容性好且在干燥过程中能够替代水的物质来替代样品中的水分，从而避免细胞结构的塌陷和变形。

目前常用的细菌SEM样品置换方法主要包括临界点干燥法和化学置换干燥法两大类。

一、临界点干燥法

临界点干燥法是目前应用最广泛的细菌SEM样品置换方法。该方法利用物质的临界点特性，将样品中的水缓慢置换成二氧化碳等临界流体，并在临界点以上将流体排出，避免了由于表面张力导致的细胞结构破坏。具体步骤如下：
固定：使用戊二醛或多聚甲醛等固定剂固定细菌样品，以保持其形态结构。
脱水：将固定后的样品进行一系列梯度酒精脱水，逐步将水置换成酒精。脱水步骤需要谨慎操作，确保脱水充分而不会导致细胞结构的损伤。常用梯度为：30%、50%、70%、90%、100%酒精，每一步都需要足够的时间。
临界点干燥：将脱水后的样品转移到临界点干燥仪中，用液态二氧化碳置换酒精，然后缓慢升温升压至二氧化碳的临界点（温度31.1℃，压力7.38MPa）。在临界点以上，液体和气体界限消失，二氧化碳以超临界状态排出，避免了表面张力的影响。
镀膜：临界点干燥后的样品需要进行镀膜处理，以增加样品表面的导电性，防止电子束充电效应。常用的镀膜材料包括金、铂或其他导电金属。

临界点干燥法能够有效避免细胞结构的塌陷，获得高质量的SEM图像，但该方法需要专门的临界点干燥仪器，成本相对较高，操作也较为复杂。

二、化学置换干燥法

化学置换干燥法利用一些具有良好亲水性和挥发性的化学试剂，逐步置换样品中的水分，避免了表面张力的作用。常用的置换剂包括叔丁醇、丙酮等。其步骤与临界点干燥法相似，但干燥过程是在常温常压下进行的，避免了临界点干燥法中对设备的要求。
固定和脱水：与临界点干燥法类似，进行固定和梯度酒精脱水。
化学置换：用叔丁醇或丙酮等置换剂逐步置换酒精。
空气干燥：将样品在空气中缓慢干燥。
镀膜：干燥后的样品需要进行镀膜处理。

化学置换干燥法操作简便，成本低廉，但其干燥效果不如临界点干燥法，容易导致细菌细胞结构的轻微收缩和变形。因此，选择合适的置换剂和干燥条件至关重要。

三、其他方法及注意事项

除了上述两种主要方法外，还有一些其他的样品置换方法，例如低温扫描电镜技术，可以直接观察未经干燥处理的湿样品，避免了干燥过程中的细胞损伤，但是需要配备相应的低温扫描电镜设备。此外，样品制备过程中需要注意以下几点：
选择合适的固定剂和脱水剂，并控制好时间和浓度，避免对细菌细胞结构造成损伤。
选择合适的置换剂和干燥方法，根据样品的特性选择最佳方案。
镀膜厚度要适中，过厚会遮盖样品细节，过薄则导电性不足。
观察样品时，选择合适的倍数和电子束能量，避免样品损伤。

总而言之，细菌SEM样品置换技术是获得高质量SEM图像的关键步骤。选择合适的样品置换方法，并严格控制每个步骤的条件，对于获得清晰、真实的细菌形态结构图像至关重要。 研究者需要根据自身条件和研究目的选择合适的制样方法，并不断优化实验流程，才能获得最佳的实验结果。

2025-09-20

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