细菌固定及扫描电镜（SEM）制样技术详解225

扫描电子显微镜（SEM）以其强大的成像能力，成为观察微生物形态结构的重要工具。然而，细菌等微生物样品本身极其微小且易变形，直接观察往往难以获得清晰、真实的图像。因此，在进行SEM观察前，对细菌样品进行恰当的固定处理至关重要。本文将详细介绍细菌固定及SEM制样技术的各个环节，帮助读者更好地理解和掌握这项技术。

一、细菌固定：保持样品原始结构的关键

细菌固定是指利用物理或化学方法迅速杀死细菌，同时尽可能保持其原始的三维结构和表面形态。不恰当的固定方法会导致细菌细胞变形、收缩或结构破坏，最终影响SEM观察结果的准确性。常见的细菌固定方法主要有化学固定和物理固定两种。

1. 化学固定：化学固定利用化学试剂与细菌细胞内的蛋白质、核酸等大分子发生反应，使其交联或变性，从而稳定细胞结构。常用的化学固定剂包括：

(1) 戊二醛 (Glutaraldehyde): 一种常用的交联剂，能够有效地固定细胞的蛋白质，保持细胞的形态和结构。戊二醛的渗透性较好，能够穿透细胞壁和细胞膜，对细胞内部结构进行固定。使用浓度一般为2.5%-4%。

(2) 甲醛 (Formaldehyde): 另一种常用的固定剂，能够与蛋白质发生反应，使其变性，从而固定细胞结构。甲醛的渗透性较好，但其固定效果不如戊二醛稳定。通常与戊二醛联合使用，以提高固定效果。常用浓度为4%。

(3) 酒精 (Ethanol): 主要作用是脱水，但也能起到一定的固定作用。常用于与其他固定剂联合使用，例如戊二醛-酒精固定法。

(4) 奥司米酸 (Osmium tetroxide): 主要用于增强细胞膜的对比度，使细胞膜在SEM图像中更容易观察。奥司米酸是一种强氧化剂，具有毒性，使用时需谨慎。

化学固定剂的选择应根据具体的细菌种类和实验目的而定。通常情况下，戊二醛是首选的固定剂，可以单独使用或与其他固定剂联合使用，以获得最佳的固定效果。

2. 物理固定：物理固定主要采用快速冷冻的方法，将细菌样品迅速冷冻到-196℃（液氮）以下，以避免冰晶形成对细胞结构的破坏。这种方法可以最大限度地保持细菌的原始形态，但操作要求较高，需要专门的冷冻设备。

二、SEM制样：从固定到成像的步骤

细菌固定完成后，需要进行一系列的制样步骤才能进行SEM观察。这些步骤包括脱水、干燥、喷金等。

1. 脱水：化学固定的样品需要进行脱水处理，将样品中的水分逐步替换成脱水剂，防止干燥过程中产生气泡和样品变形。常用的脱水剂包括乙醇、丙酮等。脱水过程通常采用梯度脱水法，逐步提高脱水剂的浓度，以确保脱水过程平缓。