冷冻扫描电镜(cryo-SEM)技术详解：样品制备、成像原理及应用288

冷冻扫描电镜 (cryo-SEM)，也称低温扫描电镜，是一种强大的显微成像技术，它允许在低温条件下对样品进行观察，从而最大限度地减少样品因暴露在环境中而造成的损伤和变形。与传统的扫描电镜相比，cryo-SEM能够对水合状态下的生物样品、含水材料以及其他对电子束敏感的样品进行高分辨率成像，揭示其真实的微观结构和形态特征。这使得它在生命科学、材料科学、食品科学等众多领域获得了广泛的应用。

一、cryo-SEM 的工作原理

cryo-SEM 的核心在于样品制备过程中的低温处理。样品在极低的温度下（通常在-140℃到-196℃之间）进行制备和观察，以避免样品的冰晶形成和结构变化。这主要通过快速冷冻技术实现，例如高压冷冻或喷雾冷冻，将样品迅速冷却到其玻璃态转变温度以下，从而形成非晶态的冰，避免了由于冰晶生长造成的样品损伤。随后，样品在低温条件下进行镀膜，通常采用铂或金等重金属进行喷镀，以增加样品的导电性和防止样品充电效应，从而获得清晰的图像。

在成像过程中，扫描电镜发射的电子束与样品表面相互作用，产生各种信号，例如二次电子、背散射电子等。cryo-SEM 通常利用二次电子信号来成像，二次电子对样品表面的形貌信息非常敏感，能够提供样品的高分辨率三维表面图像。由于样品在低温条件下保持其原始状态，cryo-SEM 所获得的图像能够真实地反映样品的微观结构，避免了传统SEM中由于脱水、固定等预处理步骤造成的样品伪影。

二、cryo-SEM 的样品制备

cryo-SEM 的样品制备是获得高质量图像的关键步骤，其流程通常包括以下几个步骤：
样品快速冷冻：这是cryo-SEM样品制备的核心步骤，目的是将样品快速冷却至玻璃态转变温度以下，避免冰晶的形成。常用的快速冷冻方法包括高压冷冻、丙烷冷冻和喷雾冷冻等。高压冷冻能够实现更快的冷冻速度，适用于较厚的样品；丙烷冷冻和喷雾冷冻则更适用于较薄的样品。
样品断裂：冷冻后的样品通常需要进行断裂，以暴露样品的内部结构。这通常是在液氮温度下进行的，可以使用预冷的刀片或专用断裂装置进行。
样品镀膜：为了提高样品的导电性和减少充电效应，需要对样品进行镀膜。通常采用铂或金等重金属进行喷镀，镀膜厚度一般控制在几纳米到几十纳米之间。
低温转移：在整个制备过程中，需要将样品置于低温环境中，以防止样品升温而发生结构变化。这需要使用专门的低温转移装置，将样品从制备环境转移到扫描电镜的样品仓。

三、cryo-SEM 的应用

cryo-SEM 具有广泛的应用前景，其主要应用领域包括：
生物医学研究：cryo-SEM 可以用于观察各种生物样品，例如细胞、组织、微生物等，无需进行化学固定和脱水，可以保留样品的原始形态和结构，例如观察细胞膜的结构、病毒颗粒的形态、组织的微观结构等。
材料科学：cryo-SEM 可以用于研究各种材料的微观结构，例如聚合物、纳米材料、食品材料等，特别是对于含水材料，cryo-SEM 可以避免样品因脱水而造成的结构变化。
食品科学：cryo-SEM 可以用于观察食品的微观结构，例如冰淇淋、面包、肉类等，研究食品加工过程对食品结构的影响。
环境科学：cryo-SEM 可以用于观察环境样品，例如土壤、水体中的微生物等，研究环境变化对微生物的影响。

四、cryo-SEM 的优势和局限性

优势：
能够在低温条件下观察样品，避免样品因暴露在环境中而造成的损伤和变形。
能够对水合状态下的生物样品、含水材料以及其他对电子束敏感的样品进行高分辨率成像。
能够提供样品真实的微观结构和形态信息。

局限性：
样品制备过程比较复杂，需要专业的设备和技术。
图像分辨率受到低温条件和样品充电效应的影响。
仪器成本较高。

总之，cryo-SEM 作为一种先进的显微成像技术，为我们研究各种样品的微观结构提供了强大的工具。随着技术的不断发展和完善，cryo-SEM 的应用范围将会越来越广泛，并在科学研究和工业应用中发挥越来越重要的作用。

2025-06-15

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