细菌扫描电镜（SEM）样品制备：高效固定方法详解174

扫描电子显微镜（SEM）以其强大的成像能力，成为观察细菌形态结构的利器。然而，要获得高质量的细菌SEM图像，样品制备至关重要，其中固定步骤尤为关键。不恰当的固定方法会导致细菌形态发生改变，影响最终的观察结果，甚至导致实验失败。本文将详细介绍细菌SEM固定技术的要点，帮助大家获得清晰、真实的细菌图像。

一、 为什么要进行细菌SEM固定？

活细菌在真空中极易脱水、变形，无法保持其自然形态。SEM观察需要在真空环境下进行，因此必须对细菌进行固定处理，使其结构稳定，防止在干燥和电子束轰击下发生收缩、破裂等形态变化。 固定作用在于快速终止所有细胞活动，尽可能保持细菌细胞的原有形态和结构。 好的固定方法可以最大限度地减少样品的人为损伤，提供更真实可靠的显微图像。

二、 细菌SEM固定方法的选择

细菌SEM固定方法众多，选择合适的固定方法取决于细菌种类、研究目的以及后续的处理步骤。常用的固定方法主要包括化学固定和物理固定两种。

（一）化学固定

化学固定是利用化学试剂使细菌蛋白变性，从而维持其形态结构。常用的化学固定剂包括：
戊二醛 (Glutaraldehyde): 这是最常用的细菌SEM固定剂，能够有效地交联蛋白质，保持细胞结构的完整性。通常使用2.5%的戊二醛溶液，固定时间根据细菌种类和大小而定，一般为1-4小时，甚至更久。戊二醛固定后，需要进行后固定处理，以增强细胞膜的稳定性。
锇酸 (Osmium tetroxide): 锇酸可以与细胞膜中的脂质发生反应，增强细胞膜的稳定性，防止细胞膜破裂。通常与戊二醛联合使用，戊二醛进行初步固定，锇酸进行后固定，时间通常为1-2小时。需要注意的是，锇酸具有毒性，操作时需注意安全防护。
甲醛 (Formaldehyde): 甲醛是一种较温和的固定剂，主要用于保存细胞的抗原性，在SEM样品制备中应用较少，通常作为戊二醛的辅助固定剂。

选择化学固定剂时，需要考虑其穿透能力、固定效果以及对后续实验的影响。戊二醛和锇酸的组合是目前最常用的细菌SEM固定方案，能够提供较好的固定效果。

（二）物理固定

物理固定方法主要包括快速冷冻固定。该方法通过快速降低温度，将细菌细胞瞬间冻结，避免了化学试剂对细胞结构的破坏。冷冻固定后，需要进行冷冻干燥或冷冻替代等步骤，以去除样品中的水分。冷冻固定能够较好地保持细胞的形态，但操作难度较大，需要特殊的设备和技术。

三、 细菌SEM固定具体操作步骤

以戊二醛和锇酸联合固定为例，具体操作步骤如下：
样品收集与清洗： 从培养基中收集细菌，用缓冲液（如PBS）清洗2-3次，去除培养基中的杂质。
戊二醛固定： 将细菌悬液加入2.5%戊二醛溶液中，室温固定1-4小时，或者4℃过夜固定。
锇酸后固定： 用PBS清洗后，将样品转移到1%锇酸溶液中，室温固定1-2小时。
脱水： 用梯度乙醇脱水(例如：30%, 50%, 70%, 90%, 100%乙醇，每步15分钟)，去除样品中的水分。
临界点干燥： 使用临界点干燥仪，用二氧化碳置换乙醇，以避免样品干燥过程中产生表面张力，导致细胞变形。
喷金： 用溅射镀膜仪在样品表面喷涂一层薄薄的金属金，增加样品的导电性，防止在电子束扫描过程中产生充电效应。
SEM观察： 将样品置于扫描电镜下进行观察和拍照。

四、 注意事项

在进行细菌SEM固定过程中，需要注意以下几点：
固定剂的浓度和固定时间需要根据细菌种类和实验要求进行调整。
操作过程中需保持样品的清洁，避免污染。
使用锇酸时需注意安全防护，避免接触皮肤和眼睛。
临界点干燥是获得高质量SEM图像的关键步骤，需要严格按照操作规程进行。
喷金的厚度需要适中，过厚会掩盖样品的细节，过薄则导电性不足。

总之，细菌SEM固定是一个复杂的过程，需要仔细操作和认真选择合适的固定方法和试剂。只有掌握了正确的技术，才能获得高质量的SEM图像，为后续的科研工作提供可靠的数据支撑。

2025-05-27

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